特稿|百年前歐洲逝者的肺部「遺書」:1918大流感元兇直接後代尚在?

1918年3月,美國堪薩斯州Riley堡的軍營(Camp Funston) 中,超過100名士兵感染了類似流感的疾病,一周之內,病例增加5倍。如今,回溯一個世紀前的1918年大流行,這一軍事基地通常是記錄這場災難性疫情的起點,儘管它的源頭仍然是謎。

這場大流感也被稱為「西班牙大流感」,原因僅在於西班牙首先報導了這場流感的真實情況。美國歷史學家 約翰·馬克斯韋爾·Hamilton就曾談到,「西班牙大流感」的稱呼十分不妥。他認為,彼時正值第一次世界大戰,只是因為西班牙當時是中立國,沒有戰時新聞審查制度。而交戰國美國、德國、英國、法國等,都有那樣的新聞審查制度,他們不想讓大流感的消息影響戰爭。

1918年至1919年,三波疫情感染了當時全球近1/3(約5億人)的人口。嚴重性超乎想像,相比其他大流行的致死率(小於0.1%),1918年大流感致死率高於2.5%。最終造成多少人死亡?持續的研究認為,這一流行病的全球死亡率估計持續向上修正。

20世紀20年代的計算結果為2150萬左右。1991年的一篇論文將死亡人數修訂為2470萬至3930萬之間。2000年之後,這一數字繼續向上修正至大約有5000萬。然而,必須承認,即使是如此巨大的數字也可能大大低於實際死亡人數,目前有觀點認為有1億以上的人口付出了生命的代價。

更令科學界至今不解的是,1918年大流行殺死了大量健康的年輕人。它的死亡曲線顯示出了獨特的、此前從未記錄過的「W型」曲線,除了幼年和老年人群, 20-40歲人群新增加了一個死亡高峰。實際上,近一半的1918年大流感死亡來自該年輕群體。

自然界和人類社會的第一次大衝突留下很多謎團。無論是對傳染性病原體的認識,還是科學研究工具,幾代科學家的努力和付出最終讓所有這些產生了一個又一個突破。對1981年出生於法國西南部城市蒙托邦的Sébastien Calvignac-Spencer來說,揭開謎團的交接棒已經到了他們這代人的手中。

「我對過去幾個世紀呼吸道病原體的進化很感興趣,1918年大流行病毒當然也在我們的『雷達』範圍內。」Spencer在接受澎湃新聞(www.thepaper.cn)記者採訪時談到,他們在一開始搜尋那些保存在病例博物館的標本時,「相當於撒下了一張相當大的網,但我們一度認為可能找不到1918年大流感時期的樣本。」

Spencer說最終結果是幸運的。研究團隊在柏林Charité和維也納Narrenturm的病理博物館標本中找到了突破口。實際上,在他們之前,關於1918年大流感病毒的所有知識僅從18個檔案標本中獲得,Spencer等人發現的來自德國的3份含有病毒遺傳物質的樣本,為這場漫長的「破案」增添了一些新的線索。

「當我們拿到這些樣本的時候,很明顯,這對我們來說是一個重要的項目。」Spencer認為,這些新的線索和他們獲得的結論仍然只是整個大流感故事中的冰山一角,「這項研究中3個完整的基因組、2個部分基因組和16個帶有單一基因片段的樣本,只能給我們一個非常粗略的概念。」他們的最新成果於近日發表於國際學術期刊《自然-通訊》(Nature Communication),Spencer為通訊作者。

1918年和1919年發生了什麼?大流感病毒最終又以何種方式「消失」於歷史……探尋永遠在路上。

永久凍土下埋藏的答案

眼下仍在全球高潮迭起的COVID-19大流體的病原體保持神秘的時間並不久。

疫情暴發初期,中國的研究團隊在數天時間內從標本中檢測出一種新型SARS樣冠狀病毒,並通過高通量測序獲得了該病毒的全基因組序列。隨後的2020年1月14日,世界衛生組織(WHO)正式將引發此輪肺炎的病毒命名為2019-nCoV(後被正式命名為「SARS-Cov-2」)。 

值得一提的是,上述病毒全基因組序列的公佈,是這場大流行中疫苗快速研發等相應抗疫舉措的首要前提。

在一個世紀之前,這樣的速度是不可想像的。儘管1918年有初步報告已經猜測,彼時的流感大流行是由病毒引起,但直到20世紀30年代這一猜測才被證實,當時有證據表明疾病與流感病毒有關。

為了找尋早已「銷聲匿跡」的殺手,年輕的瑞典微生物學家、愛荷華大學博士生Johan Hultin在1951年前往阿拉斯加州蘇厄德半島一個叫布瑞維格米申的海邊村莊。那裡的永久凍土之下,埋藏著科學界尋找已久的答案。

1918年11月,彼時的這一小村莊里約有80名成年人,大部分為因紐特人。但在當年的11月15日至20日的5天期間,流感大流行奪去了其中72人的生命。美國疾控中心官網對該事件的記錄中寫道,關於病毒是如何到達這個小村莊的,有不同的說法。然而,無論是附近城市的商人乘坐雪橇帶來,還是當地的郵遞員傳播,它對當地人口的影響是有充分記錄的。

村莊旁邊的山上,當時的逝者被凍結在了永久凍土中,用小小的十字架標記。25歲的Hultin相信,在這片保存完好的墓地里,他或許仍能找到1918年病毒原本的痕迹。

阿拉斯加布瑞維格米申,1918年大流行時,這個小村莊的80名成年居民中有72人被埋在這裏。
1951年,Johan Hultin(左)和他的同事們第一次來到Brevig Mission。

然而,無論是物流難題,還是科學技術受限,從遙遠的小村莊帶回的樣本並沒有讓Hultin找到他期望中的答案。

46年後的1997年,另一位年輕的分子病理學家、美國武裝部隊病理學研究所(AFIP)的Jeffery Taubenberger等人在《科學》雜誌上發表了一項研究,他們利用PCR技術,分別克隆了1918年大流感病毒的4條基因(HA、NA、NP和Matrix基因)的部分序列,並進行測序。通過有限的部分序列信息,Taubenberger基本確定了1918年大流感病毒是一種新的甲型H1N1流感病毒。

Taubenberger的團隊從一名駐紮在南卡羅來納州的21歲美國男性士兵的肺組織中提取了病毒的RNA。資料顯示,1918年9月20日,這名士兵被診斷為流感感染和肺炎,住進醫院。6天後,也就是1918年9月26日,他去世了,肺組織樣本被收集並保存下來。

讀到Taubenberger等人發表在《科學》上的這篇論文的時候,Hultin已經72歲了。他重燃了「偵探」到完整病毒的希望,並且寫信給Taubenberger,詢問對方是否有興趣回到布瑞維格米申,從埋在阿拉斯加永久凍土中的1918年病毒受害者身上獲取肺組織。

一周後,Hultin帶著簡陋的工具再次前往46前曾經去過的那個地方。流傳下來的一個有趣細節是,他還借了妻子的花園剪刀來協助挖掘。Hultin自己支付了旅費,個人花費約32007美元,挖掘工作耗時約5天。但這次「遠征」讓他最終獲得了非凡的發現。

72歲的Johan Hultin,時隔46年再次來到Brevig Mission。

在約7英尺深的永凍層中,埋葬著一名25歲左右(死亡時間)、肥胖的因紐特女人的屍體。她被Hultin命名為「Lucy」,脂肪保護了肺部組織免於腐爛,因此也保留了病毒的RNA。Hultin將肺組織取出,放入保存液中,然後分別運送給Taubenberger和他的同事們,包括武裝部隊病理學研究所的Ann Reid博士。

10天後,Hultin接到了他期盼了半個世紀的訊息:科學家們確實從Lucy的肺組織中獲得陽性的1918年病毒遺傳物質。

隨後的1997年至2005年,科學家們相繼對1918年流感病毒的8條基因片段(HA,NA,NS1,Matrix,NP,聚合酶基因PA、PB1、PB2)的全基因組序列進行了測序。

儘管基因序列數據還是不能回答病毒的起源和流行病學特徵,但這是幾代科學家奮鬥已久的里程碑成果。

「這類研究的最大困難顯然是樣本的稀缺性,而我們的分析必須要依賴這些微小的數據集。」Spencer對澎湃新聞記者如是表示。

首個來自歐洲的1918年大流感病毒基因組

在1918年流感病毒全基因組序列獲得之際,Spencer正在法國里昂攻讀博士學位,研究已滅絕棕熊(Ursus arctos)種群的遺傳多樣性和古病毒學。

2010年,Spencer來到了德國柏林,進入羅伯特·科赫研究所(RKI);2015年開始,他成為研究所的永久研究員,擔任病毒進化組組長、高致病性微生物流行病學研究組副組長。目前其主要研究微生物多樣性和進化(主要是病毒)、撒哈拉以南非洲的人畜共患病和哺乳動物的多樣性。

Spencer提到,當他們開始這項工作之前,關於1918年大流感病毒的所有知識僅從18個標本中獲得,並且沒有關於大流行早期階段的全基因組信息。

總體而言,1918-1919年大流行期間,第一波春季潮開始於1918年3月,並在接下來的6個月不同程度的擴散至美國、歐洲甚至亞洲,患病率非常高,但多數地區的致死率並沒有顯著高於正常值。第二波秋季潮開始於1918年9-11月,迅速在全球蔓延且高度致命。第三波流行潮則始於1919年初。

他們在論文中詳細提到,從20世紀90年代末確定了病原體為甲型 H1N1 流感病毒起,科學家們從1918年9月死於紐約阿普頓營(簡稱CU)和1918年11月死於阿拉斯加布瑞維格米申(簡稱BM)的病例身上,重建了兩個完整的基因組。此外,科學家還從1918年5月至1919年2月期間死於流感的美國(n=14)和英國(n= 2)的其他流感死亡者身上獲得了15個血凝素(HA)基因的部分序列和1個完整序列。

Spencer等人認為,這些序列為了解1918年大流行的起源、後果以及病毒表型提供了一些見解。1918年大流感病毒所攜帶的至少7個片段(HA除外)似乎來自於禽宿主中傳播的甲型流感病毒(IAV株)的多樣性,這些片段被傳播給季節性H1N1流感病毒。此前也有研究顯示,對基於上述BM病例基因組序列的傳染性1918大流行病毒重建表明,血凝素和聚合酶復合基因可能是該病毒致病性的主要決定因素。

然而,由於信息的缺乏,許多問題仍未解決或仍在爭論中。Spencer等人提到,例如,在大流行期間產生了多少基因組多樣性?在大流行高峰前和高峰期間觀察到的嚴重程度的變化是否歸因於不同的病毒遺傳特徵?在隨後的季節性H1N1病毒中,血凝素的起源是什麼?

「任何新的基因組,都可以增加我們的知識。」但Spencer同時補充道,這些大多保存在福爾馬林中的標本在過去和現在都有著不好的「名聲」,「難以合作。」

為了探索大流行不同階段病毒之間的差異,研究團隊選擇了1900年至1931年之間的13份由福爾馬林固定的肺部標本,這些標本保存在柏林Charité(n=11)的和維也納Narrenturm(n=2) 的病理博物館中。這組標本包括了歐洲大流行期間收集的6個標本(1918年4份, 1919年2份)。

這些組織此前經福爾馬林固定石蠟包埋的方法(FFPE)處理,想要提取出其中的核酸並非易事。研究團隊將豌豆大小的肺片洗凈處理,熱處理逆轉福爾馬林造成的大分子交聯,進行核酸提取。之後的步驟就是建立高通量測序文庫,然後進行測序。

「我認為這篇論文最酷的部分是,他們能夠從這些福爾馬林固定的組織中提取出這些序列。」沒有參與這項研究的佛蒙特大學拉納醫學院的病毒學家Emily Bruce評價道。

Spencer也談到,永久凍土層保存的屍體和大流行死亡者的病理標本非常罕見,獲取大量基因組可能是無法做到的。而從檔案樣本中提取核酸的最新進展,讓他們有了對這些探索研究過的歐洲病理學樣本探索的機會。

研究團隊獲得3份1918年大流感病毒的陽性樣本,即MU-162(慕尼黑)、BE-572(柏林)和BE-576(柏林)。

論文細節顯示,MU-162取自1918年死於慕尼黑流感相關肺炎的一名17歲女童,具體採集日期沒有報告。病理表現為化膿性支氣管炎、細支氣管炎和雙側合並支氣管肺炎;BE-572樣本取自1918年6月27日死於柏林的一名18歲男性士兵。病理表現為嚴重膿性假膜性氣管支氣管炎和膿性出血性支氣管肺炎;BE-576樣本取自1918年6月27日在柏林死於流感的另一名17歲男性士兵。病理表現為纖維性支氣管炎和膿性出血性支氣管肺炎。

研究團隊對這些樣本進行測序,分別獲得40.133.161、31.989.479和14.965.377的高質量讀長。這允許他們重建MU-162的完整的1918流感病毒(平均覆蓋深度為1944 x),以及BE-572和BE-576的部分基因組(分別為89.3%和57.2%,平均覆蓋深度分別為53x和9x)。

這裏需要指出的是,上世紀70年代興起的DNA重組技術,是生物醫學領域具有里程碑意義的事件,這使得人類可以對DNA進行克隆和改造。美國紐約西奈山醫學院著名的微生物學家Peter Palese博士和Adolfo Garcia-Sastre博士在1999年就開發了將流感病毒基因組克隆到特殊的DNA載體,產生重組活流感病毒的技術(反向遺傳學技術),這項技術是研究流感病毒基因功能有效的遺傳學工具。

這項技術為重建1918年大流感病毒鋪平了道路。然而,對於重建20世紀最致命的流感病毒的決定,仍然是在相當謹慎的情況下做出的。這項重建工作最後由受過訓練的微生物學家Terrence Tumpey博士一個人完成,地點被指定在亞特蘭大的美國疾控中心總部。

Terrence Tumpey博士。

Tumpey的工作始於2005年夏天。為了減少對同事和公眾的風險,他被要求獨自研究這種病毒,而且只有在同事們下班回家的幾個小時之後。進入BSL-3E實驗室需要進行生物指紋掃描,而病毒冷藏庫只有通過對他的眼睛進行虹膜掃描才能進入。Tumpey還被要求每天服用規定的預防劑量的流感抗病毒藥物奧司他韋,防止受到感染。

當1918年大流感病毒在他的細胞培養中出現的那一天,Tumpey在一封郵件中寫道,「這是我的一小步,是人類的一大步。」

Spencer表示,重建MU-162的完整基因組,這是北美以外、首個來自歐洲的1918年大流感病毒的基因組。另外至關重要的一點是,他們也獲得了第二波秋季高峰期前的樣本。

樣本的獲得彌足珍貴,Spencer同時談道,「我們不知道這個樣本的代表性如何,但顯然,如果考慮一個維度,比如地理因素,我們有了一個數據集。」他希望,來自歐洲樣本的研究能為將來的進一步努力打下堅實的基礎。

古老的肺部「遺書」:讀到了哪些信息?

結合上述提到的此前已有的BM和CU序列,研究團隊首先利用這些新獲得的德國流感病毒基因組評估了不同地理位置和不同月份的毒株的基因組多樣性。

分析顯示,1918年6月從柏林採樣的兩個部分基因組在HA基因片段中最多兩個位點存在差異,這表明在當地和當時的時間點,疫情內的可變性可能可以忽略不計。當將幾乎完整的來自柏林的BE-572基因組與來自慕尼黑的另一個德國序列(MU-162)進行比較時,發現了22個SNP(單核苷酸多態性),與此前報導的兩個北美基因組的差異相似。歐洲和北美基因組的比較顯示出22-43個SNP。

研究團隊還將大流行高峰期前的歐洲BE-572基因組((1918年6月)與大流行高峰期基因組CU(1918年9月)和BM(1918年11月)進行比較,分別鑒定出22和29個SNP。

他們認為,總的來說,這些比較表明,存在可測量的基因組可變性,在相同大陸(0.11-0.16%)和在大流行同期(0.11%)採樣的基因組比在不同大陸(0.16-0.32%)和不同時期(0.16-0.21%)採樣的基因組總體差異更低。

這就意味著,這些基因組多樣性與本土傳播和長距離擴散相結合的事件也是一致的。

為了評估觀察到的基因組差異是否有表型影響,研究團隊進行了體外探索性研究。他們發現,BM的聚合酶活性比MU-162高2倍。為了確定導致這種差異的亞基,他們通過在BM和MU-162之間交換單個聚合酶亞基來進一步分析。將PA從MU-162引入到BM聚合酶復合物中,其活性降低了1.7倍。與這一發現一致,BM PA使MU-162聚合酶的活性提高了1.7倍。PB1和PB2亞基的交換對活性也有類似的影響,但影響較小。NP交換則無影響。

為了更精確地確定所觀察到的表型差異的遺傳決定因素,研究團隊還生成了BM點突變體,每個突變體攜帶MU-162病毒中發現的一個氨基酸(aa)變化。最後發現分佈在PA(3)、PB1(1)和PB2(1)的5個突變顯著降低了聚合酶的活性。

這些結果表明,在體外,這些氨基酸變化影響了病毒RNA聚合酶復合物的活性,而聚合酶復合物在平衡病毒毒力中起關鍵作用。

他們同時強調,觀察到的差異是否會轉化為獨特的表型仍然存在很多不確定性。但他們的結論是,如果這項研究的發現不一定能夠預測體內功能差異,那麼在現階段,這符合1918年流感病毒表型多態的概念,應該鼓勵未來對這個問題的研究,使用更多的病毒序列和可能的重建病毒。

研究還進一步分析了1918年大流感流行期間病毒的地理傳播和功能演變。Spencer等人認為,研究支持了大流行病毒跨大西洋移動的假設,與第一次世界大戰末期人類遷徙的歷史背景一致。

美國疾控中心對1918年大流感的歷史介紹中也同樣提到:1918年,一種新的流感病毒出現了。與此同時,第一次世界大戰正在進行。第一次世界大戰的條件(過度擁擠和全球軍隊調動)促進了1918年流感的傳播。

研究團隊認為,總之,基因組數據支持了一種以本地傳播為主、伴有頻繁的遠距離傳播事件的情景。

他們還使用了相同的HA序列數據集,關注了不同時期病毒之間的進化關係。他們的數據強烈支持與單一的單系譜系不同的另一種情況,即多個大流行高峰前譜系在接下來的大流行幾個月都存活了下來。

針對第一波和第二波大流行之間致病性的差異,Spencer等人還專門研究了病毒可能在大流行高峰期前和高峰期之間出現的適應性,並可能導致後者的嚴重程度增加。aa殘基G222存在於H1亞型HA蛋白受體結合域,該殘基對禽類和人類聚糖都具有結合親和力,而類人D222只有效地結合人類聚糖。

這項研究中最新測序的3株德國HA已攜帶了類人D222,研究團隊認為,這降低了這兩種變異在大流感流行高峰前和高峰期間發生顯著變化的可能性。

但他們同時識別出另外兩種可能標誌著流感高峰期和流感高峰期之間重要區別的aa變化。他們發現,高峰前毒株BE-572和BE-576攜帶NP位點16 (G)和283 (L)禽類殘基,而高峰期毒株和MU-162(採樣日期未知)攜帶D16和P283。這兩個位點已知會影響干擾素誘導的MxA抗病毒蛋白的宿主範圍和易感性/耐藥性。

研究團隊認為,這些突變可能代表了早期適應人類的特徵:在其傳播的最初幾個月,1918年流感病毒可能進化出更好的躲避先天干擾素反應的能力,這是流感病毒致病性的一個重要方面。

值得關注的是,研究團隊通過分析還認為,在1918年流感大流行結束後開始傳播的季節性H1N1流感病毒(直到1957年H2N2流感大流行被取代),是流感大流行病毒的直接後代。值得注意的是,隨後的1968年,H3N2流感病毒取代H2N2病毒,引發大流行;2009年,H1N1流感病毒再現。

科學家們此前就曾將1918年大流感與隨後的季節性流感聯繫起來。在過去,有研究提出,大流行後出現的季節性H1N1病毒是重組的結果,即感染同一宿主細胞的病毒之間基因交換,這意味著與其他流感病毒交換基因後病毒可能變得不那麼致命。

Spencer等人在這篇論文中寫道,新的分析符合季節性H1N1病毒可能是由大流行流感直接演變而來,不需要重組。然而,研究同時強調,鑒於建模方法的局限,目前證據還不能讓他們完全肯定地支持該結論。

Spencer對澎湃新聞記者總結稱,他認為,相對頻繁的跨大西洋傳播是可信的。另外,1918年流感大流行的第一年,多種流感譜系持續存在。而第一波和第二波大流行比較的兩個基因組中存在潛在的適應性。

他同時強調,為了更好地了解這場大流行,需要獲得更多的基因組。以他們在這項研究中的最後一個結論,即季節性H1N1病毒可能是由大流行流感直接演變這一點來說,「可以通過在大流行期間和20世紀20年代進行更多採樣來加強研究。」可惜的是,「後面這10年沒有進一步數據。」Spencer表示。

Spencer最後談到,其研究過去流行病的動機之一,在於「希望找出共通的一些規律和模式。」放置在當下COVID-19大流行之下,他尤其提醒,「了解共同特徵和差異將有助於我們做好準備。」

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