科技 新浪科技 肝神在上:誰能拯救七千萬慢性丙肝病患?

肝神在上:誰能拯救七千萬慢性丙肝病患?

  來源:返樸

  撰文:何笑松(加州大學戴維斯醫學院退休教授)

  丙肝是肝癌的一個主要致病因素。全球約有7100萬人感染丙肝病毒,世衛組織估計,2016年,約有39.9萬人死於丙肝導致的肝硬化和肝細胞癌(原發性肝癌)。我國丙肝感染約有1000萬例,中疾控數據顯示,2019年新發病數有近22萬。

  好在,丙肝是可以治愈的。感謝科學家們幾十年堅持不懈的努力,隨著抗丙肝病毒特效藥的問世,徹底消除丙型肝炎這一惡疾的目標已經有望實現。

  今年的諾貝爾生理學或醫學獎得主是發現丙型肝炎病毒的三位病毒學家。其中,第一位發現丙型肝炎的科學家阿爾特,在苦苦尋覓丙肝病毒的途中,曾吶喊道:請「肝神」指一條明路吧!

  2020年10月5日,諾貝爾獎委員會宣布,病毒學家阿爾特(Harvey J。 Alter)、霍頓(Michael Houghton)、萊斯(Charles M。 Rice)三人共同獲得2020年的生理學或醫學獎,獲獎理由是「發現丙型肝炎病毒」。這是繼1976年的乙型肝炎病毒諾貝爾醫學獎之後,為第二種肝炎病毒的發現所頒發的諾獎。

  病毒性肝炎是一大類常見病。感染肝臟、引起肝炎的病毒共有五型。這些病毒傳染的途徑和預后各不相同。五型肝炎中最常見的是甲、乙、丙三型,危害最大的則是乙型和丙型。甲型肝炎病毒通過糞-口途徑傳染,預后較好,絕大多數患者能自行清除病毒,完全康復,不會轉變成慢性感染。乙型和丙型病毒通過血液和身體的密切接觸傳染。成年人被乙型或丙型肝炎病毒感染后,相當一部分患者(乙型約10%,丙型約70%)轉變為慢性肝炎,終身攜帶病毒。病毒攜帶者即使沒有臨床癥狀,仍可通過血液將病毒傳給他人。乙型和丙型肝炎病毒的慢性感染大大增加了發生肝硬化,乃至肝癌等終末期肝病的風險,嚴重影響患者的健康和生命。

  據世衛組織(WHO)估計,全球共有大約7100萬慢性丙肝患者,2016年一年死於由丙肝病毒造成的肝硬化或肝癌人數近40萬。中國的慢性丙肝患者人數約為1000萬 。乙肝病毒危害的人數更是數倍于丙肝病毒。

  由此不難理解,為什麼乙肝和丙肝病毒的發現者都贏得了諾獎。雖然兩種病毒的發現前後相隔二十年,二者發現的經過都充滿了戲劇性。本文講述關於丙肝病毒的故事,但這必須從乙肝病毒的發現說起。

   輸血后肝炎之謎

  19世紀末到20世紀上半葉是現代醫學快速發展的黃金時期,注射器的發明、藥物針劑以及輸血和血液製品的推廣使用,拯救了無數的生命。與此同時,醫學界也注意到這些治療措施有時會導致肝炎。病人接受輸血后發生肝炎,成為臨床上一個棘手的難題。據估計,20世紀中期,在美國接受輸血后發生肝炎的比例曾高達30%。由於對引起肝炎的病原體一無所知,也就無從鑒別哪些供血者和血液樣品帶有傳染性。為了防止發生輸血后肝炎,尋找肝炎病原體已經成為刻不容緩的緊急任務。

  就在此時,有兩位科學家正關注著一項與肝炎風馬牛不相及的研究。1964年,美國遺傳學家布倫堡(Baruch Blumberg)與美國國立衛生研究院(NIH)一名年輕的研究人員阿爾特(Harvey J。 Alter)開始合作,研究世界各地的不同人群中,由遺傳因素造成的血清中所含蛋白質成分的差異。

  他們發現,在一名澳大利亞土著居民的血液中,有一種獨特的蛋白質,能被紐約市一名血友病患者的血清中所含的抗體識別。

  血友病是一種遺傳病,病人血液中缺少某些凝血因子,使得凝血功能受損,微小損傷即可造成嚴重出血。這些病人需要經常接受輸血,或輸入由血液製成的濃縮凝血因子來進行治療。如果所接受的血液中含有病人自身的免疫系統從未接觸過的異源蛋白質(抗原),病人就可能產生與之相應的特異性抗體。布倫堡將他新發現的這種蛋白質命名為「澳大利亞抗原」,簡稱「澳抗」。那個血友病人血清中所含的特異性抗體可以用來探測其它血液樣品中是否存在澳抗。

  美國的一般人群帶有澳抗的比例不高,布倫堡對澳抗這種蛋白質的功能也一無所知。然而,兩個偶然遇到的病例,將布倫堡的研究引向了一個全新的方向。

  布倫堡的實驗室中有個女技術員,工作中經常接觸含有澳抗的血清樣品。由於自己的血液中不含澳抗,因此她通常用自己的血清作為澳抗陰性的實驗對照。1967年的一天,她感覺不適,而且出現黃疸癥狀,被診斷為肝炎。當她再次採集自己的血清來測定澳抗時,發現已從陰性轉為陽性。另外一個病例是澳抗陰性的唐氏症患者,在被研究期間得了肝炎,澳抗也由陰轉陽。布倫堡於是恍然大悟,將澳抗與肝炎聯繫起來。

  與此同時,紐約血液中心有個叫普林斯(Alfred Prince)的研究人員,也利用來自一名接受過多次輸血治療的血友病人的血清抗體,在一批輸血后肝炎患者的血液中找到一種與肝炎密切相關的新抗原,隨後普林斯又發現,這種抗原就是已知的澳抗。

  遺傳學家布倫堡無心插柳柳成蔭,一個華麗轉身成為公認的肝炎病毒研究先驅, 並因此榮獲1976年的諾貝爾醫學獎。獲獎理由是「發現澳大利亞抗原,並且證明它與血清性肝炎(輸血后肝炎當時的名稱)的聯繫」(儘管有人認為普林斯對證明這一聯繫的貢獻比布倫堡更大)。

  雖然此時澳抗的本質仍屬未知——可能是導致肝炎的病原體(肝炎的原因),也可能是人體患肝炎后產生的反應(肝炎的結果)——但阿爾特已經敏銳地意識到,對供血者普遍進行澳抗的篩選,將有助於防止輸血后肝炎。於是他開始為此發聲呼籲。

  進一步的研究發現,澳抗就是乙型肝炎病毒的外殼蛋白質,它被正式命名為「乙型肝炎表面抗原」。緊隨乙肝病毒之後,甲型肝炎病毒也被發現,相關的診斷試劑隨之被開發出來,可以準確方便地鑒別出被甲肝、乙肝病毒感染的病人。尤其重要的是,乙肝病毒攜帶者可以沒有任何肝炎臨床癥狀,他們的血液如果被用於輸血,就可能讓接受者染上乙肝。在阿爾特與其同事的大力推動下,澳抗發現的短短几年後,全美所有的血庫都對供血者實行了強制性的乙肝表面抗原篩選。

  這一措施顯著降低了輸血后肝炎的發病率,但是並沒有像人們期待的那樣,杜絕輸血后肝炎的發生。 最初,這被歸咎於檢測方法不夠靈敏,血液中抗原濃度較低時可能漏檢;但在新的檢測方法大幅度提升靈敏度以後,輸血后肝炎依然存在。

  到了1970年代末,乙肝表面抗原發現的十年之後,阿爾特等人終於確定,除了乙型肝炎之外,還存在其它類型的肝炎,可通過血液傳染。阿爾特籠統地稱之為非甲非乙型肝炎,因為還不了解它的病因是一種,還是多種病原體。研究人員不得不重振旗鼓,投入新一輪的探索。

   捉摸不定的丙肝病毒

  有了發現兩種肝炎病毒(特別是乙肝病毒)的成功經驗在先,是不是就能駕輕就熟地找出非甲非乙型肝炎的病原體?

  事實證明,沒這麼簡單。

  乙肝病毒的發現過程中最關鍵的一項突破,莫過於確定澳抗與輸血后肝炎的聯繫。確定這種聯繫,依靠兩個關鍵要素:已被發現的澳抗,和能夠方便準確地探測到澳抗的抗體。可是對於非甲非乙型肝炎,研究人員對其抗原或抗體都一無所知,又該從何處著手?

  儘管情況不容樂觀,有一項重要進展還是帶來了希望。阿爾特與NIH的同事普賽爾(Robert Purcell),以及美國疾控中心(CDC)的布雷德利(Daniel Bradley)等幾個團隊發現,將非甲非乙型肝炎病人的血清注射到最接近人類的靈長類動物——黑猩猩——體內,可以引發非甲非乙型肝炎,這表明黑猩猩可以作為非甲非乙型肝炎的實驗動物模型。再以陶瓷濾器將病人血清中可能含有的細菌濾除,過濾后的血清仍然能使黑猩猩致病,這表明病原體應當是一種(或幾種)比細菌小的病毒,而非細菌。

  阿爾特的首要目標是防止輸血后肝炎的發生,為此必須找到一種方便靈敏的檢驗方法,可以清楚地區分正常血液和致病血液。可是他的團隊用盡各種傳統方法,不管是直接探測病原體,還是間接探測人體對病原體的免疫反應產物,都沒有成功。

  在此過程中,阿爾特收集整理了一套血清樣品,其中有些來自感染了非甲非乙型肝炎的病人或黑猩猩,作為陽性的標準樣品;另一些來自患有其它肝臟疾病的病人,作為陰性對照。每個樣品有一個代碼,只有他本人掌握解碼的密鑰。新開發的任何一種檢驗方法都必須經過這套標準樣品的測試,準確地鑒別出其中所有的陽性和陰性樣品,才能通過。

  從1978年開始,十年間,先後有多個研究非甲非乙型肝炎檢測試劑的團隊,前仆後繼地向阿爾特的這套標準樣品發起了共約20次挑戰,全都鎩羽而歸,無一例外。

  1982年,出生於英國的病毒學家霍頓(Michael Houghton)移居美國,加入舊金山灣區新成立的凱榮(Chiron)公司,主持非甲非乙型肝炎病原體的研究。團隊里有兩位骨幹,華裔博士郭勁宏(George Kuo)和朱桂霖(Qui-Lim Choo)。八十年代初,正是以重組DNA為代表的分子生物學研究方興未艾之際,霍頓決定摒棄著眼于病毒的蛋白質產物的傳統策略,另闢蹊徑,採用基因克隆的方法,直接尋找病毒的遺傳物質——核酸(DNA或者RNA)。

  劃時代的重組DNA技術是在上世紀七十年代初期誕生的。美國斯坦福大學的伯格(Paul Berg)成功地把分別來自兩種不同病毒的兩個DNA片段準確地拼接到一起,成為一個連續的重組DNA分子。一年後,伯格的同事科恩(Stanley Cohen)和加州大學的博耶(Herb Boyer)使用質粒構建重組DNA分子,把伯格的結果向前又推進一步。

  質粒是大腸桿菌中常見的一種環狀DNA分子,它獨立於細菌染色體之外,可以自主複製)。科恩把質粒從細菌中分離出來,在特定的位置切開,插入一段來自不同生物(可以是病毒,或者任何高等動植物,乃至人類)的、帶有特定基因的DNA片段,再連結成環狀,然後將所得到的重組質粒送回大腸桿菌細胞。隨著細菌的生長,細胞中的重組質粒也得到複製擴增——這一過程就叫做基因克隆。質粒就是用來克隆外源基因的載體。任何一種基因通過克隆之後,就可以很容易地在細菌中大量製造出來,供各種研究所用。除了質粒,還有一種感染大腸桿菌的DNA病毒,叫做 λ 噬菌體,也可以作為克隆外源基因的載體。

  基因克隆的第一步是取得帶有病毒的樣品——患非甲非乙型肝炎的病人或黑猩猩的肝臟或血漿,從中分離出核酸,將RNA轉化成DNA,與經過切割的 λ 噬菌體載體混合,使之形成重組DNA分子。這樣得到的產物叫做基因文庫,其中包含大量的重組DNA分子,每個分子帶有一個外源基因的插入片段,絕大多數來自病人或者黑猩猩本身的基因組,一小部分可能來自肝炎病毒。

  怎樣鑒別出那些專屬於病毒的基因呢?

  霍頓首先嘗試分別構建兩個基因文庫,一個使用肝炎患者的核酸,另一個使用健康個體的核酸,然後通過一些特殊手段,排除兩個基因文庫共有的基因,只留下肝炎基因文庫特有的基因。採用這樣的方法,他果然找到了一批只存在於肝炎基因文庫的外源基因片段。可是進一步的測試表明,這些都是在感染肝炎病毒后表達量增加的宿主基因產物,代表著宿主對病毒的反應,而不是病毒本身的基因。這個結果表明,實驗的思路是正確的,但或許是由於病毒基因的含量太低,所用方法的靈敏度不夠,所以失敗了。霍頓只能改弦更張,嘗試別的辦法。

  為了提高病毒基因篩選的靈敏度和特異性,減少假陽性結果,在郭勁宏的建議下,霍頓決定採用針對肝炎病毒蛋白質的特異性抗體,但不是用它去直接探測臨床樣品中的病毒蛋白質,而是間接篩選克隆到噬菌體載體上的病毒基因在細菌里合成的蛋白質產物。

  但是,這樣的抗體從何而來?唯一可能的來源就是非甲非乙型肝炎病人的血清。

  然而,這些血清中究竟有沒有霍頓想要的抗體,如果有的話,含量是不是足夠,誰也不知道。以乙肝為例,病人血液中有大量的病毒表面抗原,但是卻沒有針對錶面抗原的抗體。只有到了肝炎痊癒,病毒被清除后,這樣的抗體才會出現。可是當時卻還沒有發現罹患非甲非乙型肝炎后自行恢復的病例。

  搜尋未知病毒就像是在大海里捕撈一種從來沒有人釣到過的魚。假定在一片海域可能有這種魚出沒,但此魚的口味十分特殊,只咬一種從來沒人用過、其它魚類一概不吃的魚餌。漁夫不知道這個魚餌是什麼,於是就準備了一大批魚鉤和他所能找到的所有的不同食材,每隻魚鉤掛上一塊,全都扔進海里,然後坐等魚兒上鉤。

  採用這樣的策略釣魚能有幾分勝算,這是所有人的疑問。但漁夫霍頓還是拿定主意,揚帆出海。為了儘可能提高基因文庫中病毒基因的含量,霍頓決定選用一份感染能力最強的非甲非乙型肝炎血液樣品來製備基因文庫。要做到這一點,多虧了肝炎的黑猩猩模型——將每個待測的病人或者黑猩猩血樣逐級稀釋,分別接種到黑猩猩體內,觀察發病情況,即可找到仍然保持感染能力的最高稀釋度。稀釋度越高,表示這份血液中所含的病毒越多。霍頓向CDC的布雷德利要到了一份患病黑猩猩的血漿,其感染能力達到已知的最高水平。他親自動手,把樣品放入離心機高速旋轉,使血漿中所含的病毒顆粒沉澱,分離出核酸,製成基因文庫,交給朱桂霖。

  朱桂霖將基因文庫按一定比例與大腸桿菌混合,使其中的一小部分細菌被重組噬菌體感染,然後將細菌均勻鋪在瓊脂培養基上。未受感染的細菌在瓊脂表面正常生長,連成一片,像草坪一樣。進入細胞的噬菌體則開始繁殖複製,同時按照所攜帶的外源基因片段合成外源蛋白質。噬菌體複製到一定程度后,細菌細胞被殺死破裂,釋放出新產生的噬菌體,再感染周圍的細菌,開始新一輪的噬菌體DNA複製和外源基因表達。如此反覆循環,最後在長滿瓊脂表面的不透明的細菌草坪中出現許多透明的斑點,叫做噬菌斑,每個噬菌斑都是因同一個原始重組噬菌體的感染而被殺死的細菌,其中含有擴增后的噬菌體,以及噬菌體所帶外源基因的蛋白質產物。只要基因文庫與細菌的比例合適,一片直徑15厘米的圓形瓊脂培養基表面可以有幾千個噬菌斑,彼此互不相連。

培養基中的白色細菌草坪上的透明圓斑即是病毒製造的噬菌斑丨來源:wikipedia培養基中的白色細菌草坪上的透明圓斑即是病毒製造的噬菌斑丨來源:wikipedia

  下一步就是用針對非甲非乙型肝炎病毒蛋白質的抗體,去釣出那些含有病毒蛋白質的噬菌斑,找到病毒基因。霍頓只能寄希望於他用來當魚餌的肝炎病人血清,希望其中恰好含有這樣的抗體。他製作的第一個基因文庫經篩選后,沒有得到任何病毒基因。於是他另起爐灶,用同一份黑猩猩血液重新製作一個基因文庫。這一次在實驗過程中不幸發生技術故障,所得到的核酸樣品外觀不很正常。他猶豫再三,最後決定還是繼續進行下去,完成了基因文庫的製作,交給同事篩選。

  同時,霍頓決定改變抗體的來源,換用一個肝臟炎症特別嚴重的肝炎病人的血清,理由是癥狀嚴重可能是因為病毒複製特別活躍,患者的免疫反應特彆強烈,血清中的抗病毒抗體含量也許就特別高。

  這一次篩選,總共得到六個陽性的噬菌斑,從中分離出六個重組噬菌體。其中是不是帶有病毒基因?由於早先的技術故障,所有人都不抱多少希望。後續的測試不出所料地將這六個克隆的基因一個接一個地排除……輪到最後一個克隆基因了,實驗記錄本上的編號是5-1-1,竟然並非來源於黑猩猩宿主的基因組,而是一個前所未知的基因,極有可能就是新病毒!

  隨後的6個月里進行的一系列測試終於沒有令人失望。5-1-1號克隆的確來自一種新病毒的RNA,但只是它的一小段。這一點難不倒研究人員。他們很快就以這個小片段作為把手,從基因文庫中把與它重疊的新病毒RNA片段逐一找到,拼接成完整的病毒RNA,發現5-1-1號克隆只佔它的1.5%。霍頓將新病毒正式命名為丙型肝炎病毒。

  值得一提的是,得到5-1-1號克隆以後,霍頓又用同一份黑猩猩血液製作了幾個基因文庫,卻再也沒有直接篩選到來自同一病毒的第二個克隆,充分說明了這條技術路線的困難程度。在不得已的情況下採取一個近乎賭博的全新策略,居然能如願以償地找到未知的新病毒,不能說不包含幾分運氣的成分。可是機遇只會眷顧永不放棄的追求者。霍頓成功的背後是整個團隊連續六年堅持不懈的努力,數不清的失敗,以及累計篩選數以千萬計的重組噬菌體的巨大工作量。

  霍頓的工作之所以意義重大,不僅在於他發現了一個臨床醫學上十分重要的新病毒,還在於他開創了一條搜尋未知病原體的全新途徑,啟迪了其他新的病原體的發現,堪稱居功至偉。

  霍頓團隊通過這條途徑發現丙肝病毒的過程之所以如此曲折艱難,主要的障礙就是丙肝病毒的遺傳物質及其基因產物在血液中的含量比其它一些病毒,例如乙肝病毒,低得多。要到以PCR為基礎的核酸擴增技術開發完善並普遍應用之後,這個障礙才被逐步克服。新一代核酸測序技術以及生物信息學的發展,更大大加快了病原體的發現和鑒定過程。時至今日,對於一種未知的新發病原體,例如新冠病毒,從採集樣品到測定病毒基因序列並確定其為新型病毒,很可能只需要短短几天。三十年來分子生物學飛速發展,帶來的變化何止天翻地覆!

  發現丙型肝炎病毒以後,霍頓團隊當即利用基因工程的方法,將病毒基因轉移到大腸桿菌和酵母菌中,製造出病毒蛋白質,作為抗原,來檢測血液中是否存在針對它們的抗體。他們發現,這樣的抗體只存在於患有丙型肝炎(即非甲非乙型肝炎)的黑猩猩血清中,而不在患有甲型或乙型肝炎的黑猩猩血中。這表明,這樣製造出來的病毒蛋白質可以作為丙型肝炎的診斷試劑!於是,霍頓向阿爾特索取了他的那套標準血清樣品,用來進行最後的評判。所有的非甲非乙型肝炎樣品都測出陽性結果,無一漏網;所有的對照樣品都測出陰性結果,明白無誤。試驗圓滿成功,阿爾特夢寐以求的丙型肝炎診斷試劑終於誕生了。

  1990年,凱榮公司的丙型肝炎診斷試劑被FDA正式批准,並用於為美國所有的血庫篩選供血者。到了1992年,美國輸血后肝炎的發病率降到了1.5%。此後,丙型肝炎診斷試劑又得到改進,檢測靈敏度進一步提高。從1992年到1997年,阿爾特跟蹤研究了650例接受輸血的病人,沒有發現一例輸血后肝炎,發病率降到了0.15%以下,與1970年相比,降幅高達200倍。

  為什麼發病率沒有完全降到零?一般認為,這並不是由於血液中還存在未知的肝炎病毒,而是因為肝炎病毒感染人體后,要經過一段時間才能產生抗體,而在這段空窗期內,血液里的病毒已經能夠傳染肝炎。採用以PCR為基礎的高靈敏度核酸擴增方法來直接探測丙肝病毒RNA,就可以解決這個殘留的輸血安全問題。

  阿爾特和霍頓對防止輸血后肝炎和發現丙肝病毒做出了傑出的貢獻,2000年,二人榮獲被視為諾獎風向標的拉斯克臨床醫學獎。

   藥物開發之爭

  1957年,英國病毒學家艾薩克斯(Alick Isaacs)和林登曼(Jean Lindenmann)正在研究流感病毒。當時已知流感病毒能感染體外培養的雞胚胎細胞,把細胞殺死。不過二人發現,如果先用加熱滅活的流感病毒處理細胞,細胞就能對流感病毒產生抵抗力,之後再遇到活病毒,也不會被感染。他們推測,雞胚細胞接觸到死的流感病毒以後能產生某種物質,抑制流感病毒的生長。他們把這種物質命名為「干擾素」。

  保護我們身體的免疫大軍中有一支前哨部隊,稱為天然免疫系統,它是人體與生俱來的保護機制,構成對抗病原體感染的第一道防線。這支前哨部隊的一個主要武器,是由人體細胞產生的具有不同免疫功能的一些小分子蛋白質,統稱為細胞因子。干擾素就是一類重要的細胞因子。繼艾薩克斯和林登曼之後,其他研究者陸續發現干擾素有許多重要的功能,例如直接抑制病毒的複製繁殖。而且干擾素的抗病毒作用沒有專一性,並非只針對流感病毒,而是對許多病毒都有效。

  早在丙肝病毒發現之前的1986年,就有人嘗試用干擾素治療非甲非乙型肝炎,並且取得了不錯的效果。1991年,干擾素被正式批准用於治療丙肝。以干擾素配合一種小分子抗病毒藥利巴韋林(ribavirin),用於丙型肝炎,可以在大約一半的病人中實現清除病毒,徹底治愈的理想效果。由此,丙肝成為干擾素在臨床應用中最主要的適應症。

  遺憾的是,干擾素療法的副作用極為嚴重。接受治療的病人會出現發熱、疲倦、肌肉酸痛等等一系列癥狀,類似得了流感。這是因為人體被流感病毒感染后,天然免疫系統受病毒刺激,產生干擾素來對抗感染。流感的臨床癥狀,在很大程度上屬於體內產生的干擾素及其它細胞因子的副作用。除此之外,干擾素還可能引起嚴重的抑鬱症。許多病人由於不能忍受這些副作用,無法完成24周到48周的正常療程,被迫降低劑量或者中斷治療,嚴重影響了療效。

  治療丙肝的高效低毒的理想藥物,直到2010年才出現。這一里程碑式的重大進展,可以追溯到丙肝病毒發現伊始的1990年代。其中的兩位關鍵人物,在他們開始進行研究時,未必預見到自己的工作日後會有如此深遠的影響。

  儘管霍頓得到的丙肝病毒基因克隆為開發丙肝檢測試劑鋪平了道路,但要證明這一新病毒的確是非甲非乙型肝炎的病原體, 還缺少最後一個關鍵證據,那就是將克隆的病毒基因組接種到黑猩猩中,能引起非甲非乙型肝炎。

  除此之外,為了研究丙肝病毒的生物學性狀,尤其是在肝細胞中複製生長的特性,就必須讓病毒在實驗室里培養的細胞中生長。丙肝病毒基因組被克隆以後,就有人將它輸入體外培養的細胞中,結果發現,雖然克隆的病毒基因組可以指導合成病毒的各種蛋白質,卻不能產生新的病毒顆粒。原因何在?

  1996年,美國聖路易斯華盛頓大學的病毒學家萊斯(Charles Rice)發現,丙肝病毒RNA分子的末端有個特別的結構,在被克隆的丙肝病毒基因組中丟失了。會不會就是這個缺失的結構影響了病毒的生長複製?

  萊斯構建了新的丙肝病毒基因組克隆,將RNA分子末端的這個結構添補回去,然後滿懷希望地把這個「完整」的病毒RNA注射到黑猩猩肝臟內。黑猩猩還是沒有得上肝炎,哪怕表現出任何遭到感染的跡象。實驗失敗了。

  不為挫折所阻,萊斯繼續探索。他進一步發現,克隆得到的丙肝病毒基因組中有一些突變。他推測,這些突變可能在被克隆之前就已存在於宿主內,也可能是在被人工克隆的過程中發生的。不論是哪一種情況,突變可能影響了病毒RNA的複製能力。那麼怎樣才能把這些突變恢復到突變發生前的核苷酸呢?

  突變發生的位點是隨機的,不同的RNA分子可能在不同的位點存在突變。萊斯分析比較了一大批克隆得到的病毒RNA分子,找到每一個存在變異的位點,在這個位點上選用最普遍的公用核苷酸來嘗試修正突變造成的變異。用這樣的方法,萊斯構建出丙肝病毒的一個「共有基因序列」,把它注射到黑猩猩體內,果然引起了肝炎!這表明,他已經得到了一個具有感染能力的丙肝病毒基因組。這一重要突破不僅坐實了丙肝病毒就是非甲非乙型肝炎的病原體,而且為丙肝病毒的分子生物學研究奠定了基礎。

  2001年,萊斯離開華盛頓大學,加盟紐約的洛克菲勒大學。洛克菲勒大學是美國歷史悠久的病毒學研究搖籃,曾經孕育了包括流感病毒、黃熱病毒、脊灰病毒等一系列重要病原體的許多重大發現。萊斯的到來又使之成為丙肝病毒的研究重鎮,取得一系列開創性的成果。

  大約與萊斯同時,德國美茵茨大學的病毒學家巴騰許拉格(Ralf Bartenschlager)也構建了一個丙肝病毒的共有基因序列。他想讓這個病毒基因組在體外培養的肝臟細胞中複製生長,卻失敗了。改用萊斯的克隆以後,還是沒有成功。

  巴騰許拉格後來轉到德國最古老的海德堡大學任教,在風光旖旎的內卡河畔繼續探索這個難題。他聯想到與丙肝病毒有親緣關係的其它一些病毒,基因組中即使丟失了某些基因,病毒RNA還能在細胞中複製。如果去掉丙肝病毒基因組中那些與RNA複製無直接關係的部分,例如編碼病毒外殼蛋白質的那些基因,只留下RNA複製所必須的部分,讓病毒丟掉包袱,輕裝上路,是不是就能提高病毒RNA在培養細胞中的複製效率?像這樣精簡而成的人造病毒結構叫做「複製子」。這一次,試驗終於成功了!

  隨後,巴騰許拉格與萊斯對複製子系統的病毒RNA以及細胞株進行了一系列改進,終於得到了可以在培養細胞中高效複製的丙肝病毒RNA。雖然複製子不帶病毒的外殼蛋白質基因,不能包裝出完整的病毒顆粒,但可以用來研究丙肝病毒RNA複製的生物學機制。更重要的是,它有可能用來在體外高效快速地篩選抑制丙肝病毒複製的化合物分子,作為治療丙肝的候選藥物。

  在此之前,有效的小分子抗病毒藥物寥寥無幾。由美國政府資助的生物醫學類研究課題中,有關艾滋病的研究在資助金額上多年獨佔鰲頭,取得的成果是由幾種抗HIV藥物聯合組成的高效抗逆轉錄病毒療法 (HAART),即所謂的「雞尾酒療法」。 它可以有效地延長患者生命,卻無法將病毒徹底清除,充分說明了開發抗病毒藥物的艱難程度。儘管如此,在丙肝病毒複製子系統問世以後,還是有一批研究人員投入了海選抗丙肝化學藥物的比拼,競爭極為激烈。

  丙肝病毒RNA的複製依靠的是蛋白質NS5B,即病毒本身的RNA聚合酶。複製所用的原料分子是核苷酸,根據病毒的單鏈RNA分子的核苷酸序列,RNA聚合酶將原料核苷酸一一連結起來,形成新的病毒RNA。丙肝病毒有許多不同的基因型,彼此之間差異很大,但是這些不同基因型的RNA聚合酶則十分相似,這意味著,只要找到一種能抑制RNA聚合酶活性的藥物,就可能對各種基因型的病毒都有效,起到事半功倍的效果。

  美國新澤西州有一家研製抗病毒藥物的小公司,叫做法莫賽特(Pharmasset),利用丙肝複製子系統找到一些化學結構類似於核苷酸的小分子化合物。這些核苷酸類似物能被丙肝病毒的RNA聚合酶誤認為是製造RNA的核苷酸原料,添加到新合成的RNA鏈上;可是這些偽裝的原料分子一旦進入位置,下一個核苷酸就再也連接不上,病毒RNA的延長就此終止。看來這些核苷酸類似物有希望成為抑制丙肝病毒RNA複製的藥物。可是,這些化合物到了動物體內后,就都出了問題,有些很快就降解失效,有些難以進入肝細胞,研究就此停滯不前。

  2005年,法莫賽特公司延聘剛離開一家大藥廠的化學家索非亞(Michael Sofia),負責抗丙肝病毒藥物的研製,希望他能將這一項目帶出困境。索非亞與他的團隊成員殫精竭慮,嘗試對那些核苷酸類似物的化學結構進行各種各樣的修改。他們發現,進入細胞的核苷酸類似物本身的抗病毒能力並不強,可是經過細胞內所含一系列代謝酶的作用,能夠轉化成為具有高活性的分子結構,有效抑制病毒RNA的複製。但原有的核苷酸類似物接受這種轉化的效率很低,必須改用另一種結構略有不同的前體。可是那種前體分子又帶有負電荷,無法穿過肝細胞表面的細胞膜。為了使它能穿膜進入肝細胞,又必須設法作進一步的修飾,將負電荷屏蔽起來……就這樣,每一個問題的解決,總是伴隨著新問題的產生。成功的希望,一次又一次地被打碎,最後目標似乎總是可望而不可及。

  索非亞早年在康奈爾大學求學,曾以本科生的身份到一個化學教授的實驗室當助手。他開始做第一個實驗時,有個研究生學長將他拉到一旁,鄭重其事地告誡:「你得明白,來做研究,你的努力只有百分之二十能成功,百分之八十全是失敗。所以你得滿足於百分之二十的成功率。要不然,就趁早別干。」 多年以後,索非亞談到研製丙肝藥物的個中艱辛時,回憶起那位師兄,說道:「現在我終於曉得,他可真是個樂天派啊!」

  經歷了無數次的失敗,索非亞與他的團隊終於成功設計出一個不帶電荷的藥物分子,可以順利地進入肝細胞內,經由肝細胞內特有的一種代謝酶的作用,脫去屏蔽,暴露出負電荷,成為活性物質的前體。由於帶有負電荷,這些前體分子無法再穿過細胞膜離開肝細胞,只能在肝細胞內逐步轉變成抑制病毒RNA複製的活性結構。同時,人體內的其它細胞不含有那種特殊的酶,不會留存藥物分子,這就大大降低了藥物對人體的毒副作用。所有研究人員孜孜以求的口服高效低毒抗丙肝藥物終於誕生了,起名為索非布韋(sofosbuvir)。當索非亞在一個專業會議上首次披露這一成果時,全場鴉雀無聲。盯著屏幕上顯示的數據,另一家公司的一個與會者喃喃地自言自語:「比賽結束了……」

  2012年,美國研製抗病毒藥物的龍頭老大吉利德(Gilead)公司以112億美元的高價收購了法莫賽特。2013年,美國FDA正式批准索非布韋用於治療慢性丙型肝炎,吉利德公司隨即將它推向市場。除了索非布韋,還有另一種藥物雷迪帕韋(ledipasvir)同樣是經由複製子系統篩選得到,但針對的靶標是丙肝病毒的另一種蛋白質NS5A。這兩種藥物聯用,只需經過8至12周的治療,94%至99%的病人都能清除病毒,徹底痊癒,而且副作用極低。

  丙肝治療特效藥的誕生過程充分說明,成功的轉化醫學研究和藥物開發離不開堅實的基礎研究。研製抗丙肝病毒藥的巨大成功,為人類消除丙型肝炎帶來了曙光。2016年,世衛組織(WHO)制定了預防和治療雙管齊下,到2030年在全球基本控制乙型肝炎和丙型肝炎的規劃。

  對於丙型肝炎來說,由於缺少有效的疫苗,實現這一目標的關鍵在於廣泛開展病毒核酸檢測,找到慢性患者,特別是無癥狀病毒攜帶者,積極進行抗病毒治療。一個沒有丙型肝炎的新世界已經出現在地平線上。這一美好願景的實現,將為丙肝研究人員近半個世紀的艱苦努力樹立一座豐碑。這一群體的三位傑出代表——阿爾特、霍頓和萊斯——榮獲2020年的諾貝爾生理學或醫學獎,自是實至名歸;然而每一獎項每年最多三人獲獎的規定,難免造成遺珠之憾。

  在此之前的2016年,巴騰許拉格、萊斯和索非亞由於對丙肝病毒體外複製系統及治療藥物作出了傑出貢獻,共同獲得拉斯克臨床醫學獎。頒獎儀式上,萊斯分享了他認識的一個家庭的故事。二十年前,這家一個幼小的女兒不幸感染了丙型肝炎。夫婦二人不知是否應讓愛女接受副作用嚴重且療效不確定的干擾素治療。痛苦糾結之中,他們找到萊斯,徵詢意見。最後夫婦二人決定暫緩治療,等待新療法的問世。就在拉斯克獎頒獎儀式的前一周,這對夫妻來信祝賀萊斯獲獎,同時向他報喜:他們的女兒經過新一代抗丙肝藥物的治療,已經痊癒,結婚,家庭幸福,有了個一歲半的女兒,而且正懷著第二胎。「作為一個從事基礎研究的科學家,沒有一項褒獎比這更大,來得更出人意料。」萊斯動情地說。

  萊斯的真情表露,代表了廣大丙肝病毒研究人員的心聲。